Random priming
浏览 2041 次
DNA聚合酶要进行DNA聚合反应时一定要有引子 (primer)，因为它只能以引子所提供的3’-OH为起始点进行延伸 (extension) 的工作，而不能就地重新合成新的DNA (de novo synthesis)。 一般实验常以人工合成的寡核苷酸为引子进行DNA聚合反应，这时固然可以根据已知序列设计核酸引子，但也可以采用逢机引子(random primers)。 所谓逢机引子即其序列为逢机序列，不经特别设计，目前应用最广者是以自动化机器所合成的、六到八个核苷酸长的寡核苷酸混合物；反应进行中若有任何一条逢机引子结合到模版DNA，即可引导DNA聚合反应的进行。 以random priming方法进行核酸标定，是以逢机引子引导Klenow fragment(large fragment of E. coli DNA polymerase I) 进行DNA聚合反应，并在反应过程中添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP等标定物质。 而为了避免random priming也发生于载体部份的DNA，最好不要直接以质体DNA为模版进行标定反应，而应预先将目标DNA自载体切除出來。
仪器用具：微量离心机；沸水浴及冰浴
药品试剂：
模版DNA (pBlueGus 的BamHI-HindIII DNA 片段，将由助教提供)
0.2 M EDTA, pH 8.0
4 M LiCl
Random priming kit (Roche)：
Hexanucleotide mix (random primer)
dNTP mixture (1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP, 0.65 mM dTTP, 0.35
mM DIG-11-dUTP, pH 7.5)
Klenow enzyme (2 U/μL)
绝对酒精
70%酒精
TE (10 mM Tris-Cl, pH 8.0; 1 mM EDTA)
方法步骤：
◆ 以下反应条件与步骤主要参照random priming kit 制造厂商所提供的产品说明书。
1) 取100 ng 模版DNA，加入适量去离子水，把体积补足为15 μL。
2) 于沸水中加热10 min。
◆ 请记得以夹子固定微量离心管的管盖部份，以免离心管在加热过程中盖子爆开、进水！
3) 加热后，迅速把微量离心管移至冰浴中，静置数分钟。
4) 离心数秒后，依序加入下列三种试剂：
2 μL hexanucleotide mix
2 μL dNTP mixture
1 μL Klenow enzyme
5) 以指头轻弹离心管，以便混合均匀。
6) 短暂离心后，置于37℃恒温水槽中作用2 h。
◆ 反应时间至少须要1 h，最长可反应过夜。
7) 作用完毕的后，加入2 μL 的0.2 M EDTA，以便终止DNA 聚合反应。
8) 加入2.5 μL 4 M LiCl及75 μL纯酒精，混合均匀，置 -20℃过夜。
隔天：
1) 于13,000 rpm，4℃离心15 min。
2) 倒出上清液，加入50 μL 的70%酒精，再离心5 min。
3) 倒出上清液并风干DNA。
4) 最后以50 μL TE 溶解DNA。
上一篇：基因会在人们选择朋友的过程中发挥作用
下一篇：抗原多肽选择的基本原则
